Développement d’agonistes sélectifs des récepteurs de la LH par hétérodimérisation avec un antagoniste des récepteurs FSH

Le récepteur de l’hormone lutéinisante (LHR) 1 et le récepteur de l’hormone folliculo-stimulante (FSHR) 2 sont des récepteurs d’hormones glycoprotéiques3,4 qui appartiennent à la grande famille des récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) et sont des médiateurs importants dans la reproduction humaine. Lors de l’activation par l’hormone lutéinisante (LH), le LHR initie une cascade de signal résultant, entre autres, dans la production d’androgènes. Chez les femelles, l’activation du FSHR par FSH induit une libération d’aromatase dans les ovaires, sur laquelle les androgènes sont convertis en œstrogènes. Les deux LH et FSH sont des membres de la famille des hormones glycoprotéiques et sont des hétérodimères composés d’une sous-unité &#x003b1 identique et d’une sous-unité β Le LHR peut être agonisé indépendamment par une autre hormone glycoprotéique, à savoir, la gonadotrophine chorionique humaine (hCG), et pour cette raison, le LHR est également appelé le récepteur hCG ou CGR.1 La glycoprotéine hCG combine le LHR / FSHR α -subunit avec encore une autre sous-unité &#x003b2. Pendant les cycles de reproduction, les deux LHR et FSHR sont souvent activés en même temps. En exerçant un contrôle sur la fertilité humaine, un accès sélectif à la voie de signalisation médiée par la LHR ou la FSHR est souhaitable. Les sous-unités β uniques des hormones glycoprotéines fournissent une sélectivité élevée dans leur liaison à l’extrémité N-terminale extracellulaire de leurs récepteurs respectifs, et ainsi, un contrôle thérapeutique sélectif dans la signalisation médiée par LHR ou FSHR peut être atteint en utilisant LH / hCG recombinant ou FSH, respectivement. Un objectif de recherche majeur dans la recherche pharmaceutique sur la fertilité humaine est d’identifier les agonistes et les antagonistes de bas poids moléculaire (LMW) qui sont sélectifs pour LHR5 et FSHR.8 − les découvertes récentes issues de ces recherches et à la base des études présentées ici sont les ligands du récepteur d’hormone glycoprotéine LMW, Org 41841 (1) 5 et (R) -tétrahydroquinoline (2) .8 Le composé 1 est un agoniste LHR puissant qui apparaît se lier à la LHR sur un site distinct de celui utilisé par l’hormone glycoprotéique naturelle LH, à savoir dans la région transmembranaire du récepteur. Bien qu’à des concentrations beaucoup plus élevées, Org 41841 (1) agonise également FSHR, et donc, le composé n’émule pas la sélectivité du récepteur de l’hormone glycoprotéique décrite par LH lui-même. Fait intéressant, des antagonistes sélectifs du FSHR ont été rapportés.8,12 Par exemple, le dérivé de la tétrahydroquinoline (R) -2 est un antagoniste puissant du FSHR pour lequel aucune activité sur d’autres récepteurs de l’hormone glycoprotéique n’a encore été rapportée. Le composé (R) -2 est un modulateur allostérique négatif et antagonise le FSHR en se liant à la région transmembranaire et est donc non compétitif par rapport au ligand glycoprotéine FSH. La dimérisation du ligand est récemment apparue comme une stratégie attrayante dans la recherche de ligands récepteurs avec des propriétés pharmaceutiques optimales. Cela est vrai en particulier pour la recherche basée sur GPCR, car plusieurs GPCR, y compris LHR et FSHR, ont fonctionné au moins en partie sous forme d’assemblages oligomériques.13 − 18 Nous avons étudié les mérites de l’approche de dimérisation tant dans la LHR agonistique19 que dans la FSHR antagonistic20 paramètres, en utilisant les composés 1 et 2, respectivement, comme points de départ (Figure ​ (Figure1) .1). En ce qui concerne le premier, nous avons précédemment établi que le dérivé d’acétylène 3 agonise le LHR et le FSHR avec des puissances comparables à celles du composé parent, Org 41841 (1) .19 Nous avons ensuite préparé des homodimères 6 à partir du dérivé acétylène 3 et en employant un double cuivre. -catalysé Huisgen [3 + 2] “ cliquez sur ” cycloaddition avec les bis-azides dérivés de l’éthylèneglycol appropriés. Nous avons trouvé que les dimères 6 étaient des agonistes de LHR moins puissants que les composés 1 et 3 mais qu’ils surpassaient leurs homologues monomères 5, composés d’une seule copie de 3 liée au bis-azide d’éthylène glycol au moyen d’un simple clic. Dans cette étude, nous n’avons pas réussi à séparer l’agonisme LHR de l’agonisme FSHR, puisque les composés dimériques 6 possédaient tous une activité agoniste sur ce dernier récepteur, bien que l’effet agoniste maximal de 6 soit considérablement plus faible pour le FSHR. Dans une étude connexe, nous avons étudié le panel de structures homodimériques tétrahydroquinoléine 8 sur leurs propriétés antagonistes FSHR.20 Les composés 8 ont été préparés à partir d’acétylène (R) -4 [lui-même un antagoniste FSHR avec une activité comparable à celle du composé parent (R) – 2] en utilisant le “ ” stratégie et en utilisant le même ensemble de bis-azides d’éthylène glycol. Bien que beaucoup moins puissants que les composés (R) -2 et (R) -4, les dimères 8 étaient capables d’antagoniser le FSHR dans la gamme micromolaire. A partir des expériences combinées et de la constatation que les dimères n’étaient pas compétitifs avec les hormones glycoprotéiques respectives, nous avons conclu que les structures dimères 6 et 8, bien que considérablement plus volumineuses que leurs homologues monomères, trouvent toujours accès à la membrane trans-membranaire LHR / FSHR Région inotrope. Au total, les résultats invitent à la conception d’un ensemble de structures hétérodimères qui englobent à la fois une entité agoniste de LHR et une fraction antagoniste de FSHR interconnectée par des espaceurs d’éthylène glycol. Dans le but d’établir si de telles structures seraient capables de agoniser le LHR sans agoniser le FSHR, nous nous sommes mis à la synthèse de structures hétérodimériques 9 (Figure 22). Figure 1Monomère et HHR homodimérique et hétérodimérique et FSHR ligands faisant l’objet des études décrites ici.Figure 2 Synthèse des composés 9a &#x02212. e) Conditions: (a) bis-azide 10a − e (5 équiv.), CuSO4 (0,2 équiv.), ascorbate de sodium (1 équiv), CH2Cl2 / H2O (33 Ȣ 56%) (b) Acétylène 3, CuSO4 (0,2 équiv.), Ascorbate de sodium (1 équiv), CH2Cl2 / H2O (75 &#… 2212; 97%) … Traitement de l’acétylène fonctionnalisé Le pharmacophore 4 avec 5 équivalents de 1,2-diazidoéthane 10a, le sulfate de cuivre (0,2 équiv.) et le carbonate de sodium (0,1 équiv.) dans un mélange 1: 1 de chlorure de méthylène et d’eau donnent le composé monomère 7a avec un rendement de 33%. produit dans cette réaction est homodimère 8a, une réaction secondaire que nous ne pouvions pas supprimer plus loin, mais 8a et 9a sont facilement séparables par chromatographie sur gel de silice. l’étape suivante, l’azide 7a et le dérivé d’acétylène 3 sont soumis aux mêmes conditions de cliquage pour donner l’hétérodimère 9a dans 75%. En suivant la même procédure en deux étapes et en partant des bis-azides d’éthylèneglycol appropriés (10b « ), on a préparé des ligands hétérodimériques 9b et des rendements globaux comparables. Nous avons ensuite entrepris de mesurer les propriétés agonistes de LHR, les propriétés agonistes du FSHR et les propriétés antagonistes du FSHR du panel de composés hétérodimériques (R) -9a − e. En tant que composés témoins, nous avons inclus les composés monomères modifiés par l’acétylène 3 et 4 dans nos dosages19,20. Comme le montrent les entrées 3 et 7 du tableau 1, tous les hétérodimères sont des agonistes puissants de la LHR. Bien que pas aussi puissant que le composé parent 3, tous agonisent le récepteur cible avec une valeur EC50 dans la gamme nanomolaire. Fait important, alors que le monomère 3 agonise le FSHR (EC50 = 126 nM), aucun effet agoniste de l’un quelconque des composés (R) -9a et # e02212; e sur le FSHR à des concentrations allant jusqu’à 10 μ M ont été observés.Dans une configuration antagoniste, les composés composés des espaceurs plus courts [(R) -9a et (R) -9b, avec n = 0 ou 1] apparaissent modérés FSHR antagonistes, tandis que les composés dans lesquels les deux pharmacophores sont reliés par des espaceurs plus longs [n = 3 − 5, les composés (R) -9c − e] sont des antagonistes de FSHR à faible valeur micromolaire (valeurs IC50). Il convient de noter, cependant, que ces composés n’ont pas antagonisé la signalisation médiée par FSHR de 100% (Imax). Une conclusion provisoire à ce stade semble que l’activité agoniste intrinsèque du pharmacophore sélectif LHR basé sur la structure Org 41841 (1) vers le FSHR est contrebalancée par la présence d’un antagoniste FSHR dédié dans la structure dimère. L’affinité de ce dernier pour le FSHR est telle que l’affinité de liaison apparente du pharmacophore Org 41841 à ce récepteur est réduite. Tableau 1 Potentiel Agoniste Méan (EC50) sur le FSHR / LHR et Puissance Antagoniste Moyenne (IC50) et Inhibition Maximale (Imax) ) sur la FSHR des composés hétérodimériques (R) -9a − eaPour exclure que la masse stérique, plutôt que les propriétés antagonistes FSHR, est à la base de la reconnaissance LHR exclusive, l’activité agoniste des composés 5c et (S) -9a &#x02212 Le composé 5c provient de notre recherche antérieure sur les agonistes de LHR homodimères, et comme nous l’avons démontré précédemment, ce composé a été mesuré sur les deux récepteurs (Figure 3, entrées 10 et # 122212, 14 dans le Tableau 1). propriétés agonistiques significatives FSHR.19 Composés (S) -9a − e englobent le distomer de l’antagoniste FSHR 2 [le stéréoisomère à l’atome de carbone chiral marqué *) et sont autrement les mêmes que (R) -9a &#x02212 e) Les composés (S) -9a et # x02212; e sont en fait des agonistes de LHR avec des pouvoirs comparable à celui de (R) -9a − e mais semble présenter une propriété agoniste FSHR faible mais significative, beaucoup plus que celle observée pour les composés (R) -9a − e. Nous avons précédemment démontré que l’énantiomère (S) du composé parent 2 et ses dérivés n’ont aucune activité sur le FSHR, et ce résultat souligne ainsi notre hypothèse que l’absence d’agonisme FSHR dans les composés (R) -9a − e est causée par la présence de l’antagoniste de la (R) -tétrahydroquinoline spécifique du FSHR dans ces structures. Figure 3Concentration − courbes d’effets (configuration agonistique) de composés sélectionnés sur des cellules CHO exprimant le LHR (gauche) ou le FSHR (droite). Les composés sélectionnés sont l’agoniste LH / FSHR monomère 5c et l’agoniste LH / FSHR hétérodimérique FSHR-LH / FSHR (R) -9c … Dans une prochaine expérience, nous avons cherché à établir si la signalisation LHR, accompagnée d’un silençage FSHR concomitant, pouvait également être atteinte par mélanger les deux composants individuels au lieu de les relier physiquement. A cette fin, nous avons mélangé l’agoniste LH / FSHR 5c avec l’antagoniste monomère FSHR 7c (Figures ​ (Figures 22 et ​ et3) .3). Alors que la puissance de ce mélange sur le LHR reste dans le même ordre de grandeur qu’en l’absence d’antagoniste (R), la puissance sur le FSHR est réduite de manière significative (P < 0,05). Ceci est en accord avec l'inhibition de la liaison FSHR de l'agoniste 5c par l'antagoniste 7c. Ainsi, lorsque l'agoniste LH / FSHR est interconnecté à l'antagoniste (R) -FSHR actif, l'activité agoniste sur le récepteur FSH est complètement abolie jusqu'à 10 μ M, tandis que le mélange des pharmacophores individuels entraîne toujours une activité agoniste significative du FSHR. . Ceci démontre l'effet additionnel des unités de reconnaissance dans le ligand dimère (R) -9c pour interagir avec le FSHR. En conclusion, nous avons démontré que lier par covalence un agoniste avec une double activité sur le LHR et le FSHR avec un antagoniste FSHR peut fournir composés qui sont agonistiques sur le LHR et non sur le FSHR. Bien que la puissance agoniste de la LHR soit quelque peu compromise par rapport aux composés parents, le gain est une activation LHR sélective sans activation de FSHR observée. Nous montrons ici que des profils uniques de sélectivité des récepteurs peuvent être obtenus en liant deux pharmacophores avec deux activités distinctes mais une réactivité croisée indésirable. Un tel profil de sélectivité des récepteurs pourrait sinon être difficile à obtenir avec des composés monomères de faible poids moléculaire.